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            透景生命 / DNA甲基化相关资料 / DNA甲基化一新一代癌症早期诊断指标(肺癌篇)

            DNA甲基化一新一代癌症早期诊断指标(肺癌篇)

            Tellgen
            2018-04-16 10:34:30  阅读量:2508

            导读:在全世界范围内,肺癌是威胁公众健康的头号恶性肿瘤,早期诊断可大大提高5年存 活率。肺泡灌洗液(BALF)由于创伤小、毗邻肿瘤细胞,有望成为肺癌的早期诊断标本。 然而,受诸多因素影响,BALF的细胞学检查灵敏度并不高。近年来,随着分子遗传学技术 的发展,灵敏度高、特异性强的肿瘤标志基因检测被广泛地应用于临床诊断、治疗及预后评 估。BALF遗传学标志物的检测有望辅助肺癌早期诊断。

            1、肺癌与DNA甲基化
            DNA甲基化是表型修饰的一种,与癌症的发生密切相关。尤其是CpG岛区的启动子超甲基 化可能会导致抑癌基因转录沉默,从而影响肿瘤发生的进程。由于DNA甲基化几乎在所有 癌症中均有发现,并且发生在癌前或者癌症早期阶段,因而有望成为癌症早期诊断的理想标 志物。矮小同源盒基因(SHOX2)和RAS相关家族1A(RASSF1A)是常见的肺癌DNA甲基 化标志物。
            SHOX2属SHOX基因家族,位于3号染色体q25-q26.1区域,编码60个氨基酸构成的DNA
            结合区域蛋白,是一种常见的转录调控因子。RASSF1A是Ras信号通路的成员,位于3号染 色体p21.3,调控细胞的增殖和自噬。研究显示,相比于肺腺癌,SHOX2基因甲基化检测对 于小细胞肺癌和鳞癌具有更高的特异性。而RASSF1A的表达下调对肺腺癌的发展至关重要。

            2、DNA甲基化检测方法
            对于特定片段的甲基化检测方法很多,包括甲基化特异性PCR (MS-PCR)、亚硫酸盐处理 +测序、联合亚硫酸盐的限制性内切酶法(COBRA)、焦磷酸测序、PCR荧光变性曲线分析 及荧光定量法(MethyLight)等。
            MS-PCR: DNA经亚硫酸盐处理后,非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保 持不变。在PCR反应时,有两套不同的引物对,分别针对经处理后的甲基化和非甲基化链, 若甲基化的链被扩增出说明发检测位点生了甲基化,若非甲基化的链被扩增出,则说明无甲 基化。
            亚硫酸盐测序:DNA经亚硫酸盐处理后,PCR扩增待测片段,随后对产物进行测序,并于 未经处理的序列进行比对,判断是否发生甲基化。
            COBRA: DNA经亚硫酸盐处理后,对待测片段进行PCR扩增,并用限制性内切酶进行切割, 完全甲基化的片段可被识别切割,非甲基化的则不能被识别切割。对酶切产物进行电泳分析, 根据条带判断样本中甲基化程度。
            焦磷酸法测序:通过酶级联反应每个dNTP的聚合与荧光信号的释放偶联,通过检测荧光的 释放和强度,可实现DNA测序的目的。
            PCR荧光变性曲线分析:DNA经亚硫酸盐处理后,对待检DNA片段进行PCR扩增,检测 DNA结合染料的荧光强度,获得待检DNA的熔解曲线。通过变性温度的不同即可区分甲
            基化与非甲基化的DNA。
            MethyLight:此法结合了亚硫酸盐修饰与Taqman探针技术。DNA经亚硫酸盐处理后,非甲 基化的C被修饰成U (扩增时被T取代),而甲基化C保持不变。随后的RT-PCR扩增过 程中,对于甲基化的样本,探针可与待检位点杂交,PCR延伸时,报告荧光基团会被Taq酶 切下释放光信号,而非甲基化样本则不能被引物结合扩增,通过检测荧光信号的强弱即可判 断DNA的甲基化状态。
            张毅敏等、Ren等及Zhang等基于此法对临床上疑似肺癌患者的SHOX2和RASSF1A基因 进行了甲基化检测,并与测序法进行了比对。在张毅敏等的研究中,两种方法对SHOX2和 RASSF1A基因甲基化检测的一致率分别为97.5%和98.0%。Ren等的研究中,一致率则分 别达到了 99%和100%。Zhang等的研究中也表现出了极好的一致性。说明了此法用于甲基 化检测的可靠性。与测序法相比,该法操作简单、成本低,且所需DNA样本量很少,减少 了样本搜集难度,故有望取代前者的甲基化检测。

            3、DNA甲基化检测助力肺癌临床诊断
            3.1大大高于传统指标的灵敏度和特异性
            张毅敏等的研究结果显示,SHOX2和RASSF1A任意甲基化阳性对肺癌的敏感性和特异性 分别为74.3%和87.1%。Ren等的研究结果与此十分接近,分别为71.5%和90%。而Zhang 等则分别达到81.0%和97.4%。Zhang等还对细胞学和血清CEA对肺癌的灵敏度进行了统 计,分别为68.3%和30.6%。
            3.2区分其他恶性肿瘤和良性疾病
            三项研究中均用其他恶性肿瘤和良性疾病做了对照,甲基化阳性率均远远低于肺癌,因而提 示SHOX2/RASSF1A甲基化检测有望用于区分肺癌和其他恶性肿瘤和良性疾病,具体数据 见表1 :
            SHOX2/RASSF1A基因甲基化任意阳性率
              张毅敏 Ren Zhang
            肺癌 74.3% 71.5% 81.6%
            良性肺病/其他恶性肿瘤 12.9% 10.0% 2.6%
             
             
             
            3.3重要的早期诊断价值
            Zhang等的研究表明,BALF的SHOX2/RASSF1A甲基化检测对I期的肺癌患者有极高的检 出率,为85.7%,远高于血清CEA和细胞学的10.7%和46.4%。Ren等的研究中 SHOX2/RASSF1A甲基化对肺癌I期检出率则为70.2%。因此,SHOX2/RASSF1A甲基化对
            于肺癌的早期诊断具有重要意义。

            4、透景肺癌DNA甲基化检测试剂盒重磅上市
            本文提及的几篇研究采用的都是透景生命开发的国际首创专利产品一一人SHOX2、


            RASSF1A基因甲基化DNA检测试剂盒(专利证号:ZL2015 1 0203539.1),产品注册证号: 国械20173403354,现已全面上市!此外,公司正在报批的同类产品还有结直肠癌Septin9甲 基化检测试剂盒,敬请期待!
            参考文献
            张毅敏,王明丽,吴杰,等.肺泡灌洗液中SHOX2和RASSF1A基因甲基化联合检测对肺癌
            的诊断价值[J].肿瘤学杂志,2016, 22(12):1032-1036.
            范保星.DNA甲基化检测方法[J].国际遗传学杂志,2002, 25(2):99-101.
            Ren M, Wang C, Sheng D, et al. Methylation analysis of SHOX2 and RASSF1A in bronchoalveolar
            lavage fluid for early lung cancer diagnosis』】]. Annals of Diagnostic Pathology, 2017, 27:57-61.
            Zhang C, Yu W, Wang L, et al. DNA Methylation Analysis of the SHOX2 and RASSF1A Panel in
            Bronchoalveolar Lavage Fluid for Lung Cancer Diagnosis. Journal of Cancer. 2017,8(17):3585-
            3591.

             
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